Changes in mechanical properties of single cells in the oxygen and glucose deprivation (OGD) model

Abstract

Udar mózgu jest jedną z głównych przyczyn zgonów u osób w wieku powyżej 40 lat. Pod względem etiologii wyróżnia się udar krwotoczny i niedokrwienny, ten drugi stanowi znaczną większość przypadków (około 90%). Przyczyną udaru niedokrwiennego jest zablokowanie światła naczynia krwionośnego (na przykład skrzepliną) prowadzące do zablokowania przepływu natlenowanej krwi przez tkankę. Obecnie w terapii udaru stosuje się leki rozpuszczające skrzeplinę (rekombinowany tkankowy aktywator plazminogenu) i przywracające przepływ krwi. Pomimo wielu badań klinicznych i setek potencjalnych leków, wciąż nie ma skutecznej terapii opartej na neuroprotekcji. Badanie zmian właściwości nanomechanicznych tkanki nerwowej oraz poszczególnych komórek może rzucić światło na mechanizmy zaangażowane w patologiczne zmiany zachodzące w komórkach podczas udaru i zrozumieć procesy molekularne, które za nimi stoją. Do oceny i wyjaśnienia zmian właściwości nanomechanicznych różnych modeli komórkowych zastosowano połączone techniki mikroskopii sił atomowych (AFM), mikroskopii konfokalnej i analizy aktywności metabolicznej. Pierwszy model oparty jest na modelu komórkowym SH-SY5Y ludzkiej neuroblastomy. Komórki poddano deprywacji tlenu i glukozy (OGD) przez 1, 3 i 12 godzin. Ich odpowiedź biomechaniczną badano bezpośrednio po ekspozycji na OGD i po 24-godzinnej reoksygenacji (24h RO). Uzyskane wyniki wykazały, że żywotność SH-SY5Y pozostała niezmieniona, ale równolegle aktywność metaboliczna komórek zmniejszała się wraz z czasem trwania OGD. Po 24h RO nie zaobserwowano powrotu do pełni aktywności metabolicznej. Komórki poddane OGD wykazywały wyższą deformowalność niż komórki kontrolne. Zwiększenie deformowalności komórek było silnie obecne w komórkach już po godzinnym OGD, a w warunkach 24h RO deformowalność komórek była na poziomie deformowalności komórek kontrolnych. Drugi model, oparty na mysich pierwotnych neuronach hipokampa, które były komórkami traktowanymi w warunkach OGD przez 1 i 3 godziny, wykazał znaczne zmniejszenie przeżywalności komórek podczas przedłużonej ekspozycji na OGD i reoksygenacji. Badania AFM, analogicznie do modelu SH-SY5Y, wykazały zwiększoną deformowalność komórek. Analiza za pomocą mikroskopu konfokalnego potwierdziła zaburzenia w organizacji sieci aktynowej oraz utratę integralności mikrotubul. Dodatkowo analiza mikroreologiczna potwierdziła zmiany we własnościach lepkich neuronów, korelujące z czasem trwania OGD. Zmiany właściwości nanomechanicznych obu modeli komórkowych przypisano przebudowie różnych składników cytoszkieletu. Zrozumienie przebudowy cytoszkieletu opierało się głównie na odpowiedzi cytoszkieletu aktynowego i jego regulacji przez białko związane z aktyną, kofilinę. W postaci aktywnej (nieufosforylowanej) kofilina odpowiada za przecięcie, zarodkowanie i rozgałęzienie cytoszkieletu aktynowego. Zastosowane modele w różny sposób reagują na warunki OGD. W komórkach SH-SY5Y za zmianę właściwości nanomechanicznych odpowiedzialny jest głównie spadek polimeryzacji aktyny. Aktywność kofiliny odgrywa rolę kompensacyjną w przedłużonej ekspozycji. W modelu neuronalnym aktywność kofiliny wzrasta, istnieje jednak wiele innych mechanizmów modulacji aktywności cytoszkieletu, w tym reorganizacja mikrotubul oraz wzrost objętości komórek (tzw. cell swelling). Przedstawione badanie pokazuje znaczenie nanomechaniki w badaniach nad procesami patologicznymi związanymi z niedokrwieniem, takimi jak udar.

Stroke is one of the leading causes of death in people over 40. Stroke is one of the leading causes of death over the age of 40. In terms of etiology, it can be divided into hemorrhagic and ischemic stroke, accounting for the vast majority of cases (about 90%). An ischemic stroke occurs when blood clots or other particles block a blood vessel's lumen, depleting supplies of fresh blood. Currently, pharmacotherapy of stroke uses drugs to dissolve the clot (recombinant tissue plasminogen activator) and restore blood flow. Despite many clinical trials and potential cures, there is still no effective therapy to protect neurons from death. Examination of alterations in nanomechanical properties of nervous tissue and individual cells might shed light on mechanisms engaged in pathological changes present in cells during stroke exposure and understand molecular processes lying behind them. Combined atomic force microscopy (AFM) techniques, confocal microscopy, and metabolic activity analysis were applied to estimate and explain alterations in the nanomechanical properties of cells subjected to oxygen and glucose deprivation (OGD). First, the changes in the nanomechanical properties of human neuroblastoma SH-SY5Y cells exposed to OGD for 1, 3, and 12h were evaluated directly after OGD and after 24h of re-oxygenation (RO). Obtained results showed that the viability of SH-5YSY cells remained unchanged, but, in parallel, the metabolic activity of these cells decreased with OGD duration. 24h RO did not recover the metabolic activity fully. Cells subjected to OGD expressed higher deformability than control cells. Cell softening was strongly present in cells after 1h of OGD and with longer OGD duration, and in RO conditions, cells recovered their mechanical properties. Next, mice primary hippocampal neurons were exposed to OGD conditions for 1 and 3h. The results revealed a significant decrease in cell survival during prolonged OGD exposure and re-oxygenation. AFM-based assessment of nanomechanical and microrheological properties of neurons showed the increased deformability of neurons and a shift in transition frequency, suggesting alterations in the cytoskeleton and cytoplasm ion equilibrium. Confocal images confirmed disturbances in actin network organization and loss of the integrity of microtubules. Additionally, microrheological analysis confirmed alterations in a viscous component of nanomechanical properties of neuronal cell cultures, which correlated with OGD duration. Changes in the nanomechanical properties observed for both cell types were attributed to the remodeling of various cytoskeleton components. Understanding of cytoskeleton remodeling was mainly based on the response of actin cytoskeleton and their regulation via actin-associated protein, cofilin. In active form (unphosphorylated), cofilin is responsible for the actin cytoskeleton severing, nucleation, and branching. Each studied cell type responded differently to OGD conditions. In neuroblastoma SH-SY5Y cells, mainly a decrease in actin polymerization is responsible for the alteration in the nanomechanical properties of these cells. Cofilin activity plays a compensatory role in prolonged exposure. In the case of neurons, the cofilin activity increases, which pointed to other mechanisms of cytoskeleton activity modulation, including microtubule re-organization, and cytotoxic cell swelling. The presented study shows the importance of nanomechanics in research on ischemic-related pathological processes such as stroke.