The role of mechanical interactions in prostate cancer therapy and cell resistance to anti-cancer drugs

Abstract

Choroby nowotworowe stanowią drugą najczęstsza przyczynę zgonów na świecie. Stąd też od wielu lat prowadzi się szeroko zakrojone badania mające na celu stworzenie skutecznych terapii przeciwnowotworowych. Badania te, często bardzo zaawansowane i oparte na rzetelnej wiedzy biologicznej, wciąż napotykają na szereg trudności. Dzieje się tak dlatego, iż komórki nowotoworowe charakteryzuje zdolność do wykształcania lekooporności. W praktyce oznacza to, że nawet bardzo mała grupa komórek, które przeżyją agresywną chemoterapię, może doprowadzić do odrodzenia się guza. Co więcej istnieje wtedy większe ryzyko, iż komórki potomne powstające w wyniku podziałów komórek lekoopornych, będą również bardziej oporne na zastosowaną chemoterapię. Badania na poziomie biologicznym i biochemicznym pozwoliły na zidentyfikowanie szeregu mechanizmów lekooporności. Wśród nich jest działanie transbłonowych pomp – stworzonych z kanałów białkowych. Pompy takie są w stanie wypompowywać leki z komórek, chroniąc je w ten sposób przed ich działaniem. Ta wiedza stała się podstawą to prób klinicznych celujących właśnie w transbłonowe pompy. Wyniki jednak, jak dotąd okazują się być rozczarowujące. Stąd też konieczne staje się znalezienie alternatwynych metod pozwalających na dokonanie trafnej oceny zarówno lekkoporności komórek rakowych jak i skuteczności działania samych leków. Mikroskopia sił atomowych jest techniką pozwalającą na badanie właściwości mechanicznych żywych komórek. W dotychczasowych badaniach pozwoliła no wykazanie, iż komórki rakowe są bardziej odkształcalne niż odpowiadające im komórki zdrowe. Celem niniejszej rozprawy doktorskiej było znalezienie odpowiedzi na pytanie, czy działanie chemioterapeutyków wpływa na własności mechaniczne komórek rakowych i czy takie zmiany można traktować jako markery lekooporności komórek raka prostaty. Z uwagi na fakt, że leki przeciwnowtworowe oddziałują na cytoskielet oraz jądra komórkowe – w niniejszej pracy rejestrowano mapy elastyczności komórek dla różnych obszarów na komórce i głębokości próbkowania. Pozwoliło to na wyznaczenie właściwości mechanicznych w obrębie jąder komórkowych oraz lamelipodiów. Przeprowadzenie tak zaawansowanych eksperymentów z zastosowaniem mikroskopii sił atomowych wymagało ich osobnej weryfikacji prowadzonej na wielokrotnie już mierzonym modelowym układzie komórek raka pęcherza moczowego. Dodatkowo badania te zostały uzupełnione eksperymentami opisującymi biologiczną odpowiedź komórek na działanie leków. Dzięki takiemu podejściu było możliwe zrozumienie znaczenia mechanicznej odpowiedzi komórek na określonym etapie biologicznego działania leku. W ostatnim etapie, wyniki uzyskane podczas standardowych eksperymentów uzupełniono o badania nad komórkami hodowanymi w warunkach imitujących środowisko guza tj. w przypadku braku składników odżywczych. Wyniki uzyskane w ramach tej pracy doktorskiej wykazują, iż komórki raka prostaty wykazują mechaniczną odpowiedź na działanie leków przeciwnowotworowych. Odpowiedź ta nie jest bezpośrednio związana z mechanizmem działania leków ale ze skutkami działania leków (w tym zdolnością do zabijania komórek rakowych). W przypadku trzech badanych leków, a mianowicie, docetakselu, winfluniny i kolchicyny, komórki sztywnieją w odpowiedzi na ich działanie. Warto zauważyć, że przeprowadzając te badania w funkcji czasu, można było wykazać zależne od czasu zmiany właściwości mechanicznych komórek oraz zidentyfikować, dla którego leku powodującego najmniejsze uszkodzenia w komórkach reakcja mechaniczna pojawia się najpóźniej. Istotny wzrost sztywności komórek zaobserwowano również w przypadku komórek głodzonych. Komórki te były również mniej podatne na działanie docetaxelu – leku przeciwnowtworowego stosowanego w terapii raka prostaty. Uzyskane wyniki potwierdzają zatem, że zmiany właściwości mechanicznych komórek pozwalają na ilościową ocenę działania leków przeciwnowotworowych.

Cancer is the second leading cause of death in the world. Hence, extensive research has been conducted for many years to create effective anti-cancer therapies. These studies, often very advanced and based on reliable biological knowledge, still encounter many difficulties. It is because cancer cells are characterized by their ability to develop drug resistance. In practice, this means that even a tiny group of cells that survive aggressive chemotherapy can lead to tumour rebirth. Moreover, there is then a greater risk that the daughter cells resulting from divisions of drug-resistant cells will also be more resistant to chemotherapy. Research at the biological and biochemical levels has identified multiple mechanisms of drug resistance. Among them is the action of transmembrane pumps - made of protein channels. Such pumps can pump drugs out of cells, thus protecting them against their effects. This knowledge became the basis for clinical trials targeting transmembrane pumps. The results, however, have turned out to be disappointing so far. Hence, it becomes necessary to find alternative methods to accurately assess both the resistance of cancer cells and the effectiveness of the drugs themselves. Atomic force microscopy (AFM) is a technique that allows you to study the mechanical properties of living cells. Previous studies have shown that cancer cells are more deformable than the corresponding healthy cells. This dissertation aims to find an answer to whether the chemotherapeutic agents affect the mechanics of cancer cells and whether such changes can be regarded as markers of drug resistance in prostate cancer cells. As anti-cancer drugs affect the cytoskeleton and cell nuclei, cell elasticity maps were recorded for different cell compartments and sampling depths. This allowed for the determination of mechanical properties within the cell nuclei and lamellipodia. Conducting such advanced experiments using atomic force microscopy required a separate validation of these methods on a model system of bladder cells that have already been measured many times. In addition, these studies were complemented by experiments describing the biological response of cells to drugs. Thanks to such an approach, it was possible to understand the importance of the physical response of the cell at a given stage of the biological drug activity. In the last step, the results obtained in standard experiments were supplemented with studies on cells grown in conditions simulating the starvation of the tumour environment. The obtained results show that prostate cancer cells show a mechanical response to the action of anti-cancer drugs. This response is not directly related to how the drugs work but to the drug effects (including the ability to kill cancer cells). For the three drugs studied here, namely, docetaxel, vinflunine, and colchicine, cells stiffen in response to their action. Notably, by conducting these studies as a function of time, it was possible to show the time-dependent changes in the mechanical properties of cells and identify for which drug causing the least damage in cells the mechanical response to appears the latest. A significant increase in cell stiffness was also observed in the case of starved cells. These cells were also less susceptible to the effects of docetaxel, an anti-cancer drug used to treat prostate cancer. Hence, the obtained results confirm that changes in the mechanical properties of cells enable a quantitative assessment of the anticancer drug effect.