Single molecule force spectroscopy study of integrins and syndecans interactions in bladder cancer cells

Abstract

Celem niniejszej pracy doktorskiej było sprawdzenie stosowalności dynamicznej spektroskopii sił AFM w opisie mechanizmu oddziaływań adhezyjnych peptydów i przeciwciał do receptorów obecnych na powierzchni żywych komórek. Praca dostarcza opisu różnic krajobrazu energetycznego wiązania wybranych fragmentów fibronektyny i monoklonalnych przeciwciał przeciwko syndekanom w zależności od stopnia złośliwości komórek nowotworu pęcherza. Hipoteza pracy zakłada, że parametry krajobrazu energetycznego oddziaływań adhezyjnych wyznaczone za pomocą dynamicznej spektroskopii sił AFM pozwalają na rozróżnienie przerzutujących i nieprzerzutujących linii komórek raka pęcherza moczowego. Praca zawiera optymalizację procedury pomiaru dynamicznej spektroskopii siły na żywych komórkach oraz analizy specyficznych oddziaływań adhezyjnych. W oparciu o dane eksperymentalne przetestowano przewidywania dwóch teoretycznych modeli pozwalających na wyznaczenie parametrów oraz rekonstrukcję obrazu energetycznego zerwania wiązania: fenomenologicznego modelu Bella-Evansa i deterministycznego modelu Dudko-Hummer-Szabo. Oba modele umożliwiają analizę zależności siły adhezji od szybkości przykładania siły zrywającej pozwalając na wyznaczenie parametrów opisujących kinetykę oraz szerokość bariery potencjału tego procesu. Wyniki posłużyły do stwierdzenia, że model Dudko- Hummer-Szabo, który jest bardziej realistyczny oraz wzbogacony o energię swobodną zerwania wiązania, charakteryzuje się wyższą wiarygodnością. Jednocześnie, model Bella-Evansa, pomimo swojego uproszczenia, może służyć do zgrubnego opisu różnic kinetyki zrywania pojedynczych wiązań. Zaangażowanie modelu Extensible Worm-Like-Chain znanego z fizyki polimerów oraz rozciągania białek było kluczowe dla postępu pracy i pozwoliło na rozróżnienie pomiędzy zerwaniem niespecyficznych wiązań od specyficznych oraz obliczenie prędkości obciążania (loading rate) siły rozciągającej w momencie tuż przed zerwaniem wiązania. Badanie wykonano przy pomocy próbników AFM funkcjonalizowanych krótkim heksapeptydem GRGDTP, dłuższym fragmentem modułu III fibronektyny FN4-12 na powierzchni niezłośliwych komórek nowotworu przewodu moczowego oraz komórek nowotworu pęcherza trzeciego stopnia złośliwości. Eksperyment z monoklonalnymi przeciwciałami przeciwko syndekanowi-1 i syndekanowi-4 został rozszerzony o panel komórek: niezłośliwego nowotworu nabłonka pęcherza moczowego, drugiego i trzeciego stopnia nowotworu pęcherza oraz przerzutujących komórek nowotworu pęcherza. Uzyskane wyniki pozwoliły na charakterystykę kinetyki oddziaływań adhezyjnych peptydów oraz przeciwciał do powierzchni żywych komórek przy zastosowaniu dynamicznej spektroskopii sił AFM. Parametry krajobrazu energetycznego wyznaczone przy zastosowaniu modeli Bell-Evansa oraz Dutko-Hummer-Szabo pozwoliły na rozróżnienie pomiędzy niezłośliwymi, złośliwymi i przerzutującymi komórkami raka pęcherza moczowego, dowodząc słuszności postawionych tez pracy doktorskiej. Uzyskany wynik nie jest jednak prostą funkcją stopnia złośliwości badanych komórek, co zostało przedyskutowane w oparciu o złożoność badanych układów biologicznych.

The doctoral thesis aims to examine the applicability of AFM dynamic force spectroscopy in the description of mechanism of peptides and antibodies adhesion to the surface of living cells. It provides insight in fibronectin fragments and syndecan monoclonal antibodies of choice binding energy landscape distinctions depending on the malignancy grade of bladder cancer cell line. The hypothesis states that differences in unbinding energy landscape parameters, measured by AFM dynamic force spectroscopy, are sufficient to distinguish between transitional, malignant, and nonmalignant bladder cancer cells. The work included dynamic force spectroscopy measurement on live cells optimization and specific adhesion forces analysis protocol. Basing on experimental data, the two theoretical models, that include unbinding energy landscape parameters reconstruction, were examined: the phenomenological Bell-Evans and the deterministic Dudko-Hummer-Szabo. Both models allow the determination of adhesion dependence on force loading rate, kinetic parameters of a process, and the corresponding bond length. The results suited to conclude that the Dudko-Hummer-Szabo model predictions are more realistic, enriched with unbinding free energy parameter, and hence more robust. Simultaneously, Bell-Evans model, despite its simplistic approach, can suit to describe the approximated differences between kinetic parameters of single unbinding events. The crucial part of this work was an incorporation of Extensible Worm-Like-Chain model known from polymer physics and proteins unfolding, in order to distinguish specific unbinding events, and to calculate system loading rates of pulling forces in the last moment before specific unbinding event. The study included experiments with AFM probes functionalized with short GRGDTP hexapeptide, and longer fibronectin III fragment FN4-12 against the surface of non-malignant cells of ureter and grade 3 bladder cancer. The experiment with AFM probes functionalized with monoclonal antibodies against syndecan-1 and syndecan-4 was extended to test a panel of five different cell lines including: non-malignant cells of ureter, grade 2, grade 3, and transitional bladder cancer cells. AFM dynamic force spectroscopy on the surface of living cells allowed to decode the peptides' and the antibodies' adhesion kinetic parameters calculated with Bell-Evans and Dudko-Hummer-Szabo models. The thesis was confirmed due to the differences in energy landscape parameters that allowed to distinguish between non-malignant, malignant and transitional cell lines. Obtained result is not a simple function of malignancy grade as discussed based on the biological systems complexity.