Celem niniejszej pracy doktorskiej było sprawdzenie stosowalności dynamicznej spektroskopii sił
AFM w opisie mechanizmu oddziaływań adhezyjnych peptydów i przeciwciał do receptorów obecnych
na powierzchni żywych komórek. Praca dostarcza opisu różnic krajobrazu energetycznego wiązania
wybranych fragmentów fibronektyny i monoklonalnych przeciwciał przeciwko syndekanom w
zależności od stopnia złośliwości komórek nowotworu pęcherza. Hipoteza pracy zakłada, że
parametry krajobrazu energetycznego oddziaływań adhezyjnych wyznaczone za pomocą
dynamicznej spektroskopii sił AFM pozwalają na rozróżnienie przerzutujących i
nieprzerzutujących linii komórek raka pęcherza moczowego. Praca zawiera optymalizację
procedury pomiaru dynamicznej spektroskopii siły na żywych komórkach oraz analizy specyficznych
oddziaływań adhezyjnych. W oparciu o dane eksperymentalne przetestowano przewidywania dwóch
teoretycznych modeli pozwalających na wyznaczenie parametrów oraz rekonstrukcję obrazu
energetycznego zerwania wiązania: fenomenologicznego modelu Bella-Evansa i deterministycznego
modelu Dudko-Hummer-Szabo. Oba modele umożliwiają analizę zależności siły adhezji od szybkości
przykładania siły zrywającej pozwalając na wyznaczenie parametrów opisujących kinetykę oraz
szerokość bariery potencjału tego procesu. Wyniki posłużyły do stwierdzenia, że model Dudko-
Hummer-Szabo, który jest bardziej realistyczny oraz wzbogacony o energię swobodną zerwania
wiązania, charakteryzuje się wyższą wiarygodnością. Jednocześnie, model Bella-Evansa, pomimo
swojego uproszczenia, może służyć do zgrubnego opisu różnic kinetyki zrywania pojedynczych
wiązań. Zaangażowanie modelu Extensible Worm-Like-Chain znanego z fizyki polimerów oraz
rozciągania białek było kluczowe dla postępu pracy i pozwoliło na rozróżnienie pomiędzy zerwaniem
niespecyficznych wiązań od specyficznych oraz obliczenie prędkości obciążania (loading rate) siły
rozciągającej w momencie tuż przed zerwaniem wiązania. Badanie wykonano przy pomocy próbników
AFM funkcjonalizowanych krótkim heksapeptydem GRGDTP, dłuższym fragmentem modułu III
fibronektyny FN4-12 na powierzchni niezłośliwych komórek nowotworu przewodu moczowego oraz
komórek nowotworu pęcherza trzeciego stopnia złośliwości. Eksperyment z monoklonalnymi
przeciwciałami przeciwko syndekanowi-1 i syndekanowi-4 został rozszerzony o panel komórek:
niezłośliwego nowotworu nabłonka pęcherza moczowego, drugiego i trzeciego stopnia nowotworu
pęcherza oraz przerzutujących komórek nowotworu pęcherza. Uzyskane wyniki pozwoliły na
charakterystykę kinetyki oddziaływań adhezyjnych peptydów oraz przeciwciał do powierzchni żywych
komórek przy zastosowaniu dynamicznej spektroskopii sił AFM. Parametry krajobrazu energetycznego
wyznaczone przy zastosowaniu modeli Bell-Evansa oraz Dutko-Hummer-Szabo pozwoliły na
rozróżnienie pomiędzy niezłośliwymi, złośliwymi i przerzutującymi komórkami raka pęcherza
moczowego, dowodząc słuszności postawionych tez pracy doktorskiej. Uzyskany wynik nie jest jednak
prostą funkcją stopnia złośliwości badanych komórek, co zostało przedyskutowane w oparciu o
złożoność badanych układów biologicznych.
The doctoral thesis aims to examine the applicability of AFM dynamic force spectroscopy in the
description of mechanism of peptides and antibodies adhesion to the surface of living cells. It provides
insight in fibronectin fragments and syndecan monoclonal antibodies of choice binding energy
landscape distinctions depending on the malignancy grade of bladder cancer cell line. The hypothesis
states that differences in unbinding energy landscape parameters, measured by AFM dynamic
force spectroscopy, are sufficient to distinguish between transitional, malignant, and nonmalignant
bladder cancer cells. The work included dynamic force spectroscopy measurement on live
cells optimization and specific adhesion forces analysis protocol. Basing on experimental data, the two
theoretical models, that include unbinding energy landscape parameters reconstruction, were examined:
the phenomenological Bell-Evans and the deterministic Dudko-Hummer-Szabo. Both models allow the
determination of adhesion dependence on force loading rate, kinetic parameters of a process, and the
corresponding bond length. The results suited to conclude that the Dudko-Hummer-Szabo model
predictions are more realistic, enriched with unbinding free energy parameter, and hence more robust.
Simultaneously, Bell-Evans model, despite its simplistic approach, can suit to describe the
approximated differences between kinetic parameters of single unbinding events. The crucial part of
this work was an incorporation of Extensible Worm-Like-Chain model known from polymer physics
and proteins unfolding, in order to distinguish specific unbinding events, and to calculate system
loading rates of pulling forces in the last moment before specific unbinding event. The study included
experiments with AFM probes functionalized with short GRGDTP hexapeptide, and longer fibronectin
III fragment FN4-12 against the surface of non-malignant cells of ureter and grade 3 bladder cancer.
The experiment with AFM probes functionalized with monoclonal antibodies against syndecan-1 and
syndecan-4 was extended to test a panel of five different cell lines including: non-malignant cells of
ureter, grade 2, grade 3, and transitional bladder cancer cells. AFM dynamic force spectroscopy on the
surface of living cells allowed to decode the peptides' and the antibodies' adhesion kinetic parameters
calculated with Bell-Evans and Dudko-Hummer-Szabo models. The thesis was confirmed due to the
differences in energy landscape parameters that allowed to distinguish between non-malignant,
malignant and transitional cell lines. Obtained result is not a simple function of malignancy grade as
discussed based on the biological systems complexity.