Elastic and rheological properties of human bladder cancer cells: from single cells to spheroids

Abstract

Wiadomo, że mechaniczne i mikroreologiczne właściwości komórek, wraz z rearanżacjami w ich cytoszkielecie aktynowym, są związane z progresją nowotworu przez przejęcie ważnej roli w badaniach nad diagnostyką nowotworów. Hodowle komórek 3D mogą naśladować naturalne środowisko komórek i niektóre cechy guzów litych, będąc szeroko stosowanymi jako potencjalne modele in vitro do odkrywania nowych cech biologicznych komórek rakowych i odkrywania leków przeciwnowotworowych. W tym badaniu do utworzenia wielokomórkowych sferoidów wykorzystano trzy linie komórkowe z różnych stadiów raka pęcherza moczowego: HCV29 (rak niezłośliwy), HT1376 (rak III stopnia) i T24 (rak przejściowokomórkowy IV stopnia). Komórki te również charakteryzują się innym cytoszkieletem aktynowym. Ich właściwości mechaniczne i mikroreologiczne są badane za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) w nanoskali oraz spektroskopii sił hydraulicznych (HFS), innowacyjnej techniki aspiracji mikropipetowej, w skali makro. Prace te skupiały się głównie na zrozumieniu, w jaki sposób zmieniają się właściwości lepkosprężyste komórek w hodowlach 2D, tj. pojedynczych komórkach, monowarstwach i sferoidach 3D. Nasze wyniki z AFM pokazują, że zarówno pod wpływem ściskania, jak i naprężenia ścinającego, komórki HCV29 są sztywniejsze niż komórki HT1376 i T24, co potwierdza, że komórki rakowe są bardziej odkształcalne niż komórki niezłośliwe, niezależnie od warunków hodowli. Następnie oceniono związane z wiekiem zmiany właściwości mechanicznych sferoidów, a wyniki porównano z analizą histologiczną przekrojów sferoid. Wyniki AFM wykazały, że wszystkie komórki stają się sztywniejsze z powodu efektu starzenia i reorganizacji ich cytoszkieletu. Zaobserwowano również, że sferoidy utworzone przez komórki HCV29 były jedynymi, które wytwarzały macierz zewnątrzkomórkową (ECM), co może wyjaśniać zmiękczenie tych sferoidów po wykryciu przez HFS. Dlatego zmiany w interakcjach komórka-komórka i komórka-ECM podczas starzenia mogą mieć duży wpływ na mechaniczne zachowanie komórek. Na koniec sprawdzono, czy właściwości mechaniczne uzyskane dzięki HFS można wykorzystać do badania wpływu docetakselu (DTX), leku przeciwnowotworowego, na trzy rodzaje sferoidów raka pęcherza moczowego. Wyniki pokazały, że trzy linie komórkowe zachowują się inaczej i że HFS może wykrywać zmiany mechaniczne wywołane przez lek, nawet w bardzo niskich stężeniach, przed pojawieniem się jakiegokolwiek markera biologicznego, co czyni HFS korzystną metodą oceny aktywności związków przeciwnowotworowych. Biorąc pod uwagę wszystkie wyniki tej pracy, dochodzimy do wniosku, że właściwości mechaniczne i reologiczne sferoidów raka pęcherza, określane za pomocą AFM i HFS, mogą służyć jako markery biofizyczne nie tylko w diagnostyce, ale także w leczeniu tego typu nowotworu.

Mechanical and microrheological properties of cells, along with the rearrangements in their actin cytoskeleton, are known to be associated with cancer progression by acquiring an important role in cancer diagnostic research. 3D cell cultures can mimic the natural environment of cells and some features of solid tumors, being widely used as potential in vitro models for finding novel biological features of cancer cells and anticancer drug discovery. In this study, three cell lines from different stages of bladder cancer were used to form the multicellular spheroids: HCV29 (non-malignant cancer), HT1376 (grade III carcinoma), and T24 (grade IV transitional cell carcinoma) cells. These cells are characterized by a different actin cytoskeleton, too. Their mechanical and microrheological properties are investigated using atomic force microscopy (AFM) at the nanoscale and hydraulic force spectroscopy (HFS), an innovative micropipette aspiration technique, at the macroscale. This work was mainly focused on understanding how the viscoelastic properties of cells change in 2D cultures, i.e., single cells, monolayers, and 3D spheroids. Our results from AFM show that under both compression and shear stress, HCV29 cells are stiffer than HT1376 and T24 cells, confirming that cancer cells are more deformable than non-malignant cells, regardless of the culture conditions. Then, the age-related changes in the mechanical properties of spheroids were evaluated, and the results were compared to the histological analysis of spheroid cross-sections. AFM results showed that all cells become stiffer due to the aging effect and the reorganization of their cytoskeleton. It was also observed that spheroids formed by HCV29 cells were the only ones to produce extracellular matrix (ECM), which could explain the softening of these spheroids when detected by HFS. Therefore, changes in cell-cell and cell-ECM interactions during aging may greatly impact the mechanical behavior of the cells. Finally, it was checked whether the mechanical properties obtained by HFS could be used to study the effects of docetaxel (DTX), an anticancer drug, on the three types of bladder cancer spheroids. The results showed that the three cell lines behave differently and that HFS could detect the mechanical changes induced by the drug, even at very low concentrations, before the appearance of any biological marker, making HFS an advantageous method to assess the activities of anticancer compounds. Considering all the results from this work, we conclude that the mechanical and rheological properties of bladder cancer spheroids, determined by AFM and HFS, may serve as biophysical markers, not only in diagnosis but also in the treatment of this type of cancer.