Application of mono-, bi- and trimetallic gold (Au NPs), platinum (Pt NPs) and palladium-based (Pd NPs) nanoparticles to enhance the proton irradiation effect of cancer cells in vitro

Abstract

Nowotwory należą do jednych z najczęstszych i najbardziej zagrażających życiu chorób cywilizacyjnych. Niestety, dostępne metody leczenia, takie jak chirurgia, chemioterapia, radioterapia, a nawet immunoterapia często nie dają satysfakcjonujących rezultatów. W związku z tym, niezmiernie ważne jest znalezienie nowych, bardziej efektywnych strategii zwalczania nowotworów. W niniejszej rozprawie doktorskiej zbadano wzmocniony, przeciwnowotworowy efekt napromieniania wiązką protonów (PIr) w obecności nanocząstek, będący rezultatem terapii wykorzystującej rozwój nanotechnologii i niepowodującej wyraźnych uszkodzeń prawidłowych komórek i tkanek, z jednoczesnym działaniem przeciw- nowotworowym. W tym celu zsyntezowano mono,- bi- oraz trimetaliczne nanocząstki (NPs) zbudowane z atomów o wysokiej liczbie atomowej Z (złota – Au NPs, platyny – Pt NPs, palladu – Pd NPs), które dodawano do rakowych oraz referencyjnych linii komórkowych, aby wykazać czy osiągnięty zostanie lepszy efekt PIr w porównaniu do PIr o takiej samej dawce promieniowania, ale bez dodatku NPs do komórek. Zatem, w niniejszej rozprawie wykorzystano interdyscyplinarne podejście, w którym wiedzę o chemicznej syntezie nanocząstek oraz mechanizmach ich wzrostu połączono z właściwościami fizycznymi otrzymanych nanostruktur mającymi bezpośredni efekt biologiczny na komórki. Badania te miały odpowiedzieć także na pytanie, jaki mechanizm: chemiczno-biologiczny czy fizyczny jest odpowiedzialny za zwiększenie śmiertelności komórek rakowych hodowanych z NPs i naświetlanych wiązką protonów. W rozprawie doktorskiej zastosowano wiele fizycznych, chemicznych i biologicznych metod w celu zweryfikowania zawartych w pracy hipotez: analizę aktywacyjną cząstkami (protonami) naładowanymi (ChPAA), transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM), spektroskopię dyspersji energii promieniowania rentgenowskiego (EDS), dyfrakcję elektronową wybranego obszaru (SAED), dyfrakcję rentgenowską (XRD), spektroskopię w zakresie nadfioletu i światła widzialnego (UV-Vis), pomiar potencjału zeta, analizę śledzenia nanocząstek (NTA), mikroskopię holotomograficzną 3D, test MTS (sól 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolowa) oraz cytometrię przepływową. W warunkach laboratoryjnych otrzymano metodą mokrej syntezy monometaliczne Au NPs, Pt NPs, Pd NPs oraz bi- i trójskładnikowe kombinacje tych NPs. Wyżej wymienione rodzaje NPs zostały wybrane ze względu na ich właściwości, takie jak wysoka liczba atomowa Z, rozmiar poniżej 50 nm, krystaliczna struktura oraz odpowiednio dobrane stabilizatory. Otrzymane NPs były dodawane do hodowli trzech linii komórkowych raka jelita grubego, cechujących się różną agresywnością i potencjałem przerzutowania, aby określić, który rodzaj NPs powoduje największą cytotoksyczność po PIr. Następnie przeprowadzono długoterminowe obserwacje komórek w czasie rzeczywistym, stosując nieinwazyjną technikę mikroskopii holotomograficznej 3D (Nanolive), uzyskując informacje na temat miejsc akumulacji NPs oraz spowodowanych akumulacją zmian gęstości NPs we wnętrzu komórek. Do wykazania kumulatywnego efektu NPs oraz PIr względem komórek, w pierwszym etapie za pomocą testu MTS wyznaczono nietoksyczne stężenia poszczególnych rodzajów NPs oraz dawki promieniowania protonowego dla wszystkich linii komórkowych. W obu przypadkach dopuszczalnym progiem było stężenie/dawka, które powodowało śmiertelność nie wyższą niż 20 % komórek. Następnie, NPs w takim wyznaczonym stężeniu dodawano do hodowli do odpowiednich linii komórkowych, które następnie naświetlono, po czym w różnych odstępach czasu oceniono ich żywotność za pomocą testu MTS oraz cytometrii przepływowej. Wyniki badań pokazały, że PIr komórek hodowanych z NPs daje większy efekt cytotoksyczny, w porównaniu do PIr bez wykorzystania NPs. Potwierdza to celowość i skuteczność stosowania nanoradiouczulaczy w terapiach antynowotworowych. Jednakże, końcowy efekt PIr zależy nie tyle od rodzaju metalu wchodzącego w skład NPs, ale bardziej od rozmiaru oraz nanostruktury (porowatości) NPs. Wykazano, że ultra małe Pt NPs oraz Pd NPs mają lepsze właściwości radiouczulające w porównaniu do pozostałych NPs. Niewielki rozmiar NPs zapewnia silnie rozwiniętą powierzchnię, a co za tym idzie – warunkuje lepsze właściwości radiouczulające. Najbardziej obiecujące wydają się tu ultra małe Pd NPs, gdyż maksymalne nie-toksyczne stężenie tych NPs było mniejsze niż ultra małych Pt NPs, a końcowy efekt działania Pt NPs i Pd NPs był zbliżony. Porównano także efekt porowatości dwóch struktur AuPd typu rdzeń-otoczka: AuPd CSs z ciągłą palladową otoczką oraz nanomalin (AuPd NRs) z porowatą palladową otoczką. Istotne jest, że oba typy NPs mają zbliżoną zewnętrzną średnicę, składają się z tych samych metali oraz to, że zostały otrzymane za pomocą takich samych reagentów w analogicznej metodzie syntezy. Wyraźnie lepsze właściwości radiouczulające wykazano dla porowatych AuPd NRs, co jest spowodowane przez silniej rozwiniętą powierzchnię tych NPs, co zapewnia lepszy kontakt z komórkami. Zdjęcia z mikroskopii holotomgraficznej 3D pokazały, że Pd NPs akumulują się w jądrach komórkowych. Dla wszystkich badanych linii komórkowych objętość zajmowana przez NPs w komórkach wzrastała liniowo wraz z czasem hodowli i zależała od linii komórkowej – najbardziej widoczne zmiany zaobserwowano dla linii SW620. Oznacza to, że dynamika wnikania Pd NPs była różna dla poszczególnych linii komórkowych. Ważnym dla zastosowań medycznych jest fakt, że komórki wszystkich linii nowotworowych były bardziej wrażliwe na PIr, NPs oraz łączoen działanie PIr z NPs, w porównaniu z komórkami prawidłowymi. Zbadano także mechanizmy interakcji komórek z wiązką protonów i NPs, które prowadzą do śmierci komórek. Wyniki ChPAA wykazały, brak występowania promieniowania gamma charakterystycznego dla nuklidów/izotopów, które mogłyby powstać w wyniku reakcji jądrowej na złocie, platynie lub palladzie, co sugeruje, że fizyczny efekt radiouczulania pełni znikomą rolę w śmierci komórek. W tym kontekście należy oczekiwać, że w radiouczulanie zaangażowany jest głównie efekt biologiczno-chemiczny opierający się na generowaniu m.in. reaktywnych form tlenu (ROS) i/lub hamowaniu podziałów komórki w fazie G2/M, w której komórki cechują się najwyższą wrażliwością na promieniowania. Podsumowując, w niniejszej rozprawie sprawdzono wpływ rozmiaru, struktury, składu chemicznego oraz wartości potencjału zeta NPs na wzmacnianie efektu napromieniowania komórek rakowych oraz prawidłowych. Wykazano, który mechanizm radiouczulania pełni kluczową role w indukcji śmierci komórek nowotworowych, poddanych działaniu NPs oraz PIr. Uzyskane wyniki pokazały, że dodatek zsyntezowanych NPs w nietoksycznym stężeniu do komórek nowotworowych, znacząca zwiększa ich śmiertelność na skutek oddziaływania NPs z wiązką protonów.

Cancers are one of the most common, life-threatening civilization diseases. Unfortunately, currently available treatment methods such as surgery, chemo-, radio- or even targeted immunotherapy often do not give satisfactory results. Therefore, it is extremely important to find new, more effective strategies to fight cancer. Consequently, taking from one side an anticancer therapy that may save normal cells and tissues, and recent developments of nanotechnology from the other, in this dissertation a potential enhancement of antitumor effect of proton beam irradiation (PIr) using noble metal nanoparticles (NPs) was investigated. For this purpose, mono-, bi- and trimetallic NPs composed of atoms with high-Z number (gold – Au NPs, platinum – Pt NPs, palladium – Pd NPs) were synthesized and added to the cultures of cancer and non-cancer reference cell lines, to find out, if a higher PIr effect can be achieved, in comparison with the same irradiation dose, but without the presence of NPs. Hence, an interdisciplinary approach was presented, where the knowledge of the chemical preparation of NPs and their growth mechanisms were combined with the physical properties of the obtained nanostructures having a direct biological effect on the cells. This study tries to answer the question, which of the mechanisms: chemical-biological or physical, is responsible for the increased death of cancer cells cultured with NPs and irradiated with a proton beam. Moreover, in this dissertation a large number of physical, chemical and biological methods, including charged-particle (proton) activation analysis (ChPAA), transmission electron microscopy (TEM), energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS), selected area electron diffraction (SAED), X-ray diffraction (XRD), ultraviolet-visible (UV-Vis) spectroscopy, zeta potential measurement, nanoparticle tracking analysis (NTA), 3D holotomographic microscopy, MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-methoxy-phenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) test and flow cytometry were used to verify the research hypotheses that had been set. Au NPs, Pt NPs, Pd NPs and bi- or ternary combinations of these NPs were laboratory synthesized using wet chemistry methods. The NPs were chosen on the basis of properties such as: high-Z number, size below 50 nm, crystalline structure and used stabilizers. The obtained NPs were added to the cultures of three colon cancer cell lines with different aggressiveness and metastatic potential to determine, what kind of NPs possess the most pronounced cytotoxicity against cancer cell after PIr. Furthermore, long term, non-invasive, real-time observations of NPs accumulation dynamics in cells were performed using a 3D holotomographic microscopy (Nanolive). Importantly, to show the combined effect of NPs and PIr on the cells, first, by cell viability assessment (MTS test), the non-toxic NPs concentrations and non-destructive proton beam dose for each cell line were determined. In both cases the threshold was below 20 % of dead cells. Next, the NPs, in the established concentrations, were added to the cultures of the respective cell lines, which were subsequently irradiated, and checked for cell viability (MTS test and flow cytometry analysis of Annexin-V binding). The obtained results showed, that PIr of cells cultured with NPs resulted in a better cytotoxic effect against cancer cells, when compared to PIr without NPs. This observation confirmed the purpose and effectiveness of applying nanoradiosensitizers in anticancer therapies. However, the final effect of combined PIr seems not to be dependent on the type of the metal used, but rather on the size and nanostructure (porosity) of the NPs. It was shown that ultra-small Pt NPs and Pd NPs possessed the strongest radiosensitizing effect compared to the others. The small size of NPs provides a highly developed surface area, and thus – more effective radiosensitizing properties. In this context, the ultra-small Pd NPs seem to be the most promising radiosensitizers, as their maximum non-toxic concentration was lower than for ultra-small Pt NPs, and the final cytotoxic effect of Pd NPs on cancer cells was similar to Pt NPs. The effect of NPs porosity was compared using two AuPd NPs structures: AuPd CSs with continuous palladium shell, and AuPd nano-raspberries (AuPd) NRs coated by a porous palladium shell. Importantly, both NPs had a similar outer diameter, consisted of the same metals, and were also obtained using the same reagents and synthesis method. Clearly better radiosensitizing properties were shown for porous AuPd NRs, which provide a highly developed surface and thus a better contact with cells. 3D holotomographic images showed, that the NPs penetrate the cells and locate in the nucleus. In all cell lines studied, the cellular volume occupied by Pd NPs increased linearly with time of culture, albeit with different, cell specific, magnitude - being most pronounced for the SW620 cells. This means, that the absorption dynamics of the Pd NPs was different for the respective cell lines. Very important finding for medical applications, is that cells from all three cancer cell lines were more sensitive to PIr, NPs and combined actions of PIr and NPs, compared to normal cells. Finally, the mechanisms leading to cell death induced by NPs addition and proton beam irradiation were studied. The results of the ChPAA showed that the gamma radiation, characteristic for nuclides/isotopes, which could arise from a nuclear reaction of gold, platinum or palladium, was not observed, suggesting, that the physical effect of radiosensitization is likely to play a negligible role in the cell death. Therefore, it is hypothesized that radiosensitization involves rather the biological-chemical effect of e.g. generating reactive oxygen species (ROS) and/or inhibiting the cell cycle in the G2/M phase, when the cells are most radiosensitive. Summarizing, in the dissertation, the enhancement of the irradiation effect of proton beam on cancer cells by the use of noble metal NPs was documented and analyzed in relation to the size, structure, chemical compositions and value of zeta potentials of NPs. It has been shown, which of the radiosensitization mechanisms play a major role in causing cell death, in particular of cancer cells, cultured with NPs and after PIr. The obtained results show that the synthesized NPs added in non-toxic concentration to cancer cell lines significantly improve the anticancer effect induced by irradiating them with the proton beam only.