Badanie wpływu promieniowania jonizującego na strukturę chromatyny z wykorzystaniem nanospektroskopii molekularnej

Abstract

STRESZCZENIE

Struktura chromatyny umożliwia upakowanie DNA, w którego nici jest zapisana informacja genetyczna. Chromatyna występuje na różnych poziomach organizacji. Na najniższym poziomie organizacji występuje w postaci nukleosomów, a na najwyższym poziomie organizacji w postaci chromosomów metafazowych. Ze względu na kluczową rolę chromatyny w organizacji DNA, został zbadany wpływ metylacji DNA i histonu H3 na jej strukturę chemiczną. Ponadto, został także zbadany udział euchromatyny i heterochromatyny w powstawaniu uszkodzeń w wyniku oddziaływania z wiązką protonów, co ma istotne znaczenie dla radioterapii. Do badań struktury molekularnej chromatyny zostały wykorzystane dwie techniki nanospektroskopii molekularnej: spektroskopia Ramana wzmocniona na ostrzu sondy skanującej (TERS, ang. Tip- Enhanced Raman Spectroscopy) oraz spektroskopia w zakresie podczerwieni połączona z mikroskopią sił atomowych (AFM – IR, ang. Atomic Force Microscopy Infrared Spectroscopy). Spektroskopia TERS umożliwiła zbadanie wpływu metylacji zarówno DNA, jak i histonu H3 na strukturę chemiczną chromatyny na najniższym poziomie jej organizacji- pojedynczego nukleosomu. Za pomocą spektroskopii AFM – IR, wykonano pomiary pojedynczych chromosomów metafazowych człowieka, czyli chromatyny na najwyższym poziomie jej organizacji. Na bazie przedstawionych w poniższej rozprawie wyników TERS, na podstawie zmiany intensywności pasma charakterystycznego dla wib. zasad A, C i G oraz δ(CH), a także C=C (1487 cm-1), zidentyfikowano dwie różne struktury nukleosomów: 1) charakteryzującą się brakiem obecności pasma dla liczby falowej 1487 cm-1 w przypadku liniowego DNA faga λ (głównie konformacja A) oraz 2) charakteryzującą się obecnością pasma dla liczby falowej 1487 cm-1 w przypadku kolistego DNA (pUC19, współistnienie konformacji A i B). Zanik intensywności pasma na pozycji spektralnej 1487 cm-1 został powiązany z powstawaniem wiązania wodorowego pomiędzy końcem NH2 kationowych reszt histonów z azotem N7 zasady guaninowej DNA w większym rowku DNA. Ponadto, w oparciu o otrzymane wyniki, stwierdzono, że na strukturę nukleosomów najistotniejszy wpływ ma konformacja DNA. Za pomocą spektroskopii AFM – IR zweryfikowano wpływ organizacji i budowy chemicznej chromatyny na powstawanie aberracji chromosomowych w wyniku oddziaływania z wiązką protonów. Pokazano, że procesy powstawania uszkodzeń radiacyjnych oraz ich naprawy prowadzące do powstania chromosomów dicentrycznych oraz pierścieniowych zachodzą głównie w euchromatynie. Podsumowując, badania nanospektroskopowe chromatyny na najniższym i najwyższym poziomie jej organizacji, umożliwiły lepsze wyjaśnienie i zrozumienie zmian spektroskopowych związanych z metylacją lub typem/konformacją DNA. Umożliwiły one także zbadanie czułości euchromatyny i heterochromatyny na uszkodzenia związane z oddziaływaniem z wiązką protonów.

SUMMARY

Genetic information is stored in the chemical structure of the DNA strand and the chromatin structure allows the DNA packing and organization. Chromatin occurs at various levels of the organization. At the lowest level of organization it forms the nucleosomes, and at the highest level of organization it forms metaphase chromosomes. Due to the key role of chromatin in DNA packing, the influence of DNA and histone H3 methylation on its chemical structure was investigated. In addition, the participation of euchromatin and heterochromatin in the formation of damage as a result of interaction with the proton beam was also examined, which is important for radiotherapy. Two nanospectroscopic methods were used to study the chemical structure of chromatin: Tip- Enhanced Raman Spectroscopy (TERS) and infrared spectroscopy combined with atomic force microscopy (AFM - IR). TERS spectroscopy enabled studies of the effect of methylation of both DNA and histone H3 on the chemical structure of chromatin at the lowest level of its organization - a single nucleosome. On the other hand, the AFM - IR spectroscopy enabled the spectroscopic measurements of individual human metaphase chromosomes, which represents the highest level of chromatin organization. Based on the presented TERS results and the decrease of the intensity of band characteristic for vibrations of DNA bases (A, C, G) and δ(CH), and C=C (1487 cm-1), two different nucleosome structures were identified: 1) characterized by no band presence at 1487 cm-1 in the case of linear phage λ DNA (mainly in A conformation) and 2) characterized by the presence of the band at 1487 cm-1 in the case of circular DNA (pUC19, coexistence of A and B conformations). Decrease of band intensity at 1487 cm-1 was related to the hydrogen bond formation between the NH2 terminal end of the cationic histone residues with the N7 nitrogen of the guanine DNA base in the larger DNA groove. In addition, based on the results obtained, it was concluded that the DNA conformation, not methylation itself, mainly influences nucleosome structure. Using AFM - IR spectroscopy, it was possible to examine the contribution of two main types of chromatin: euchromatin and heterochromatin, in the formation of chromosomal aberrations as a result of interaction with the proton beam. It was shown that chromosome breaks caused by interaction with the proton beam, related to the formation of dicentrics or rings, are formed mainly in euchromatin. In conclusion, nanospectroscopic studies of chromatin at the lowest and the highest level of its organization allowed for a better explanation and understanding of the nature of observed bands in spectra and spectroscopic changes associated with methylation or the type/conformation of DNA. They also enabled studies of the sensitivity of euchromatin and heterochromatin to damage associated with the interaction with the proton beam.